치료용 재조합 단백질의 숙주 세포 단백질(HCP) 결정을 위한 공정 특정 분석법의 개발 및 검증은 유럽 약전의 모노그래프 2.6.34에 포함된 사양을 단계별 접근 방식으로 따라야 합니다.
1. HCP 항원 생산
이 단계는 고객이 null 세포주를 사용하여 활성 물질 제조 공정의 모의 실험을 통해 수행합니다. 이 모의 실험은 HCP 생성과 관련하여 최악의 상황을 재현해야 합니다. 활성 물질의 흔적이 전혀 없음을 보장하기 위해 활성 물질에 대한 최신 분석 방법을 사용해야 합니다. 이 과정에서 HCP 성분이 손실되지 않도록 최소한의 정제(여과, 농축)를 수행해야 합니다.
2. HCP 항원의 특성화
모의 생산에서 얻은 HCP 단백질에 대한 항원은 SDS-PAGE 및/또는 2D 전기영동을 통해 감도 높은 염색법(쿠마시 블루 또는 실버)을 사용하여 분석하고, 얻어진 결과를 활성 물질의 표준 생산에서 얻은 결과와 비교해야 합니다. 가능한 한 최소한의 정제 과정을 거친 샘플과 표준 후속 공정을 거친 샘플을 사용하는 것이 좋습니다.
3. 다클론 항체 시약 생산
모의 실험에서 얻은 항원 HCP 단백질을 동물(보통 랍비)에게 투여하여 면역 반응을 유도하고, HCP 항원에 대한 항체 역가가 높은 혈청을 얻는 것을 목표로 합니다. ELISA 검사로 측정한 혈청 항체 역가가 충분히 높아지면, 각 혈청을 웨스턴 블롯으로 특성 분석하고 모든 혈청을 모아 ELISA 분석에서 HCP의 최대 범위를 확보해야 합니다.
4. 다클론 항체 시약의 정제 및 최종 특성 분석
모은 혈청은 단백질 A 또는 G 크로마토그래피로 추가 정제한 후 SDS-PAGE, 적정 및 Western Blot으로 특성화해야 합니다.
5. HCP 결정을 위한 정량적 ELISA 분석법 개발
다음 주제를 고려하여 정량적 ELISA를 개발해야 합니다.
- 가장 적합한 ELISA 형식 선택: 직접, 샌드위치, 경쟁 등.
- 시약 라벨링.
- 분석 조건 최적화.
- 분석의 특성: 민감도, 특이성, LLOQ, 범위, 최소 희석 등.
- 적합성 시험의 정의.
6. HCP 결정을 위한 정량적 ELISA 분석의 검증
ELISA 방법이 개발되면 다음 매개변수를 평가하여 방법의 검증을 수행해야 합니다.
- 특성
- 교정 범위/곡선
- 정확도와 정밀도
- 검출 한계 및 정량 한계
- 안정
- 견고성
- 희석 선형성
7. 샘플 분석
이 분석 방법은 각 제조 배치에 대해 출하를 위한 품질 관리 방법으로 사용될 수 있습니다. 각 분석에는 ELISA 개발 단계에서 수립되고 앞서 언급한 목적을 위해 GMP 실험실에서 수행된 적합성 시험이 포함되어야 합니다.
