Lo sviluppo e la convalida di un test specifico per il processo di determinazione delle proteine delle cellule ospiti (HCP) nelle proteine ricombinanti terapeutiche devono seguire le specifiche contenute nella monografia 2.6.34 della Farmacopea europea con un approccio graduale:
1. Produzione degli antigeni HCP
Questa fase viene eseguita dal cliente in una simulazione del processo di produzione del principio attivo utilizzando una linea cellulare nulla. Questa simulazione di produzione deve simulare il caso peggiore in riferimento alla generazione di HCP. Devono essere impiegati i metodi analitici più recenti per garantire che non siano presenti tracce di principio attivo. È necessario effettuare una purificazione minima (filtrazione, concentrazione) per garantire che nessun componente dell’HCP venga perso durante questo processo.
2. Caratterizzazione degli antigeni HCP
L’antigene contro le proteine HCP ottenuto nella produzione simulata viene analizzato mediante SDS-PAGE e/o elettroforesi 2D utilizzando un metodo di colorazione sensibile (blu di Coomassie o argento) e i risultati ottenuti devono essere confrontati con i risultati ottenuti da una produzione standard del principio attivo. Si raccomanda di disporre di campioni con la minima purificazione possibile e di altri che abbiano seguito il processo standard a valle.
3. Produzione del reagente anticorpale policlonale
Le proteine antigeniche HCP ottenute nella produzione simulata vengono somministrate ad animali (solitamente rabbini) per indurre la risposta immunitaria in questi animali, con l’obiettivo di ottenere sieri con un titolo anticorpale elevato contro gli antigeni HCP. Una volta che il titolo anticorpale del siero misurato con un test ELISA è sufficientemente elevato, ciascun siero deve essere caratterizzato mediante Western Blot e tutti i sieri devono essere aggregati per ottenere la massima copertura dell’HCP nel test ELISA.
4. Purificazione e caratterizzazione finale del reagente anticorpale policlonale
I sieri raccolti devono essere ulteriormente purificati mediante cromatografia proteica A o G e caratterizzati mediante SDS-PAGE, titolazione e Western Blot.
5. Sviluppo di un test ELISA quantitativo per la determinazione dell’HCP
Un test ELISA quantitativo dovrebbe essere sviluppato tenendo conto dei seguenti argomenti:
- Scelta del formato ELISA più adatto: diretto, sandwich, competitivo, ecc.
- Etichettatura dei reagenti.
- Ottimizzazione delle condizioni di analisi.
- Caratterizzazione del test: sensibilità, specificità, LLOQ, intervallo, diluizione minima, ecc.
- Definizione del test di idoneità.
6. Validazione di un test ELISA quantitativo per la determinazione dell’HCP
Una volta sviluppato il metodo ELISA, è necessario effettuare una validazione del metodo valutando i seguenti parametri:
- Specificità
- Intervallo/curva di calibrazione
- Accuratezza e precisione
- Limite di rilevabilità e limite di quantificazione
- Stabilità
- Robustezza
- Linearità della diluizione
7. Analisi del campione
Una volta raggiunto questo punto, il metodo analitico può essere utilizzato per ogni lotto di produzione come metodo di controllo qualità per il rilascio. Ogni analisi dovrebbe includere il test di idoneità stabilito nella fase di sviluppo del test ELISA e condotto in un laboratorio GMP per lo scopo sopra menzionato.
