Le développement et la validation d’un dosage spécifique au processus pour la détermination des protéines de cellules hôtes (HCP) dans les protéines recombinantes thérapeutiques doivent suivre les spécifications contenues dans la monographie 2.6.34 de la Pharmacopée européenne selon une approche étape par étape :
1. Production des antigènes HCP
Cette phase est réalisée par le client lors d’une simulation du procédé de fabrication de la substance active, en utilisant une lignée cellulaire nulle. Cette simulation doit reproduire le scénario le plus défavorable concernant la génération de protéines de la cellule hôte (HCP). Les méthodes analytiques actuelles de la substance active doivent être utilisées afin de garantir l’absence de traces de cette dernière. Une purification minimale (filtration, concentration) doit être effectuée pour éviter toute perte de composants des HCP au cours de ce procédé.
2. Caractérisation des antigènes HCP
L’antigène dirigé contre les protéines HCP obtenu lors de la production témoin est analysé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS (SDS-PAGE) et/ou par électrophorèse bidimensionnelle (2D) avec une méthode de coloration sensible (bleu de Coomassie ou argent). Les résultats obtenus sont comparés à ceux obtenus lors d’une production standard de la substance active. Il est recommandé de disposer d’échantillons ayant subi une purification minimale et d’autres ayant suivi le protocole de purification standard.
3. Production de réactif d’anticorps polyclonaux
Les protéines antigéniques HCP obtenues lors de la production simulée sont administrées à des animaux (généralement des lapins) afin d’induire une réponse immunitaire et d’obtenir des sérums présentant un titre élevé d’anticorps dirigés contre ces antigènes. Lorsque le titre d’anticorps sériques, mesuré par un test ELISA, est suffisamment élevé, chaque sérum est caractérisé par Western Blot et tous les sérums sont regroupés afin d’obtenir une couverture maximale des HCP dans le test ELISA.
4. Purification et caractérisation finale du réactif d’anticorps polyclonal
Les sérums regroupés doivent être purifiés davantage par chromatographie sur protéine A ou G et caractérisés par SDS-PAGE, titrage et Western Blot.
5. Mise au point d’un test ELISA quantitatif pour la détermination des HCP
Un test ELISA quantitatif doit être développé en tenant compte des points suivants :
- Choisir le format ELISA le plus adapté : direct, sandwich, compétitif, etc.
- Étiquetage des réactifs.
- Optimisation des conditions d’analyse.
- Caractérisation du test : sensibilité, spécificité, LLOQ, plage de mesure, dilution minimale, etc.
- Définition du test d’aptitude.
6. Validation d’un dosage ELISA quantitatif pour la détermination des HCP
Une fois la méthode ELISA mise au point, une validation de la méthode doit être effectuée en évaluant les paramètres suivants :
- Spécificité
- Plage/courbe d’étalonnage
- Exactitude et précision
- Limite de détection et limite de quantification
- Stabilité
- Robustesse
- linéarité de la dilution
7. Analyse des échantillons
Une fois ce stade atteint, la méthode analytique peut être utilisée pour chaque lot de fabrication comme méthode de contrôle qualité en vue de sa libération. Chaque analyse doit inclure le test d’aptitude établi lors de la mise au point du test ELISA et réalisé dans un laboratoire conforme aux BPF (Bonnes Pratiques de Fabrication) conformément à la finalité susmentionnée.
