Die Entwicklung und Validierung eines prozessspezifischen Assays zur Bestimmung von Wirtszellproteinen (HCP) in therapeutischen rekombinanten Proteinen sollte schrittweise gemäß den Spezifikationen der Monographie 2.6.34 des Europäischen Arzneibuchs erfolgen:
1. Herstellung der HCP-Antigene
Diese Phase wird vom Kunden in einem simulierten Herstellungslauf des Wirkstoffs unter Verwendung einer Nullzelllinie durchgeführt. Diese simulierte Produktion muss den ungünstigsten Fall hinsichtlich der HCP-Generierung abbilden. Es müssen gängige Analysemethoden für den Wirkstoff angewendet werden, um sicherzustellen, dass keine Wirkstoffspuren vorhanden sind. Eine minimale Reinigung (Filtration, Konzentrierung) sollte durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass während dieses Prozesses keine Komponente des HCP verloren geht.
2. Charakterisierung der HCP-Antigene
Die in der Scheinproduktion gewonnenen Antigene gegen HCP-Proteine werden mittels SDS-PAGE und/oder 2D-Gelelektrophorese unter Verwendung einer sensitiven Färbemethode (Coomassie-Blau oder Silber) analysiert. Die Ergebnisse sollten mit denen einer Standardproduktion des Wirkstoffs verglichen werden. Es wird empfohlen, Proben mit minimaler Aufreinigung sowie solche, die dem Standard-Downstream-Prozess unterzogen wurden, zu verwenden.
3. Herstellung von polyklonalem Antikörperreagenz
Die in der Scheinproduktion gewonnenen Antigen-HCP-Proteine werden Tieren (üblicherweise Raben) verabreicht, um eine Immunantwort auszulösen und Seren mit einem hohen Antikörpertiter gegen die HCP-Antigene zu gewinnen. Sobald der mittels ELISA gemessene Antikörpertiter im Serum hoch genug ist, wird jedes Serum mittels Western Blot charakterisiert und alle Seren werden gepoolt, um eine maximale Abdeckung der HCP im ELISA-Test zu gewährleisten.
4. Reinigung und abschließende Charakterisierung des polyklonalen Antikörperreagenz
Die gepoolten Seren sollten anschließend durch Protein-A- oder Protein-G-Chromatographie weiter aufgereinigt und mittels SDS-PAGE, Titration und Western Blot charakterisiert werden.
5. Entwicklung eines quantitativen ELISA-Tests zur Bestimmung von HCP
Ein quantitativer ELISA sollte unter Berücksichtigung der folgenden Aspekte entwickelt werden:
- Auswahl des am besten geeigneten ELISA-Formats: Direkt, Sandwich, kompetitiv usw.
- Reagenzienkennzeichnung.
- Optimierung der Testbedingungen.
- Charakterisierung des Assays: Sensitivität, Spezifität, untere Bestimmungsgrenze (LLOQ), Messbereich, minimale Verdünnung usw.
- Definition des Eignungstests.
6. Validierung eines quantitativen ELISA-Tests zur Bestimmung von HCP
Sobald die ELISA-Methode entwickelt ist, sollte eine Validierung der Methode durch Bewertung der folgenden Parameter durchgeführt werden:
- Spezifität
- Kalibrierbereich/Kalibrierkurve
- Genauigkeit und Präzision
- Nachweisgrenze und Bestimmungsgrenze
- Stabilität
- Robustheit
- Verdünnungslinearität
7. Probenanalyse
Sobald dieser Punkt erreicht ist, kann die Analysemethode für jede Produktionscharge als Qualitätskontrollverfahren zur Freigabe eingesetzt werden. Jede Analyse sollte den im Rahmen der ELISA-Entwicklung festgelegten Eignungstest umfassen, der in einem GMP-Labor für den zuvor genannten Zweck durchgeführt wurde.
